1、第一类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的；
2、第二类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，这种酶的切割可以有两种方式，一是交错切割，形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，称为粘性末端，另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端；
3、第三类限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的，因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。
