细胞毒试验基本原理
T淋巴细胞转化实验的基本原理 T细胞在体外培养时,受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后,可出现细胞体积增大,代谢旺盛,蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化.淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平,因此可作为测定机体免疫功能的指标之一. T 细胞在体外培养时,受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后,可出现细胞体积增大,代谢旺盛,蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化.淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平,因此可作为测定机体免疫功能的指标之一. 淋巴细胞转化试验有形态计数法、MTT 法和同位素法三种.MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法.MTT 是一种噻唑盐,化学名3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四唑,水溶液为黄橙色.小鼠脾细胞受到ConA 作用后发生增殖活化,其胞内线粒体琥珀酸[工业电器网-cnelc]脱氢酶活性相应升高,MTT 作为其底物参与反应,形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围,经盐酸─异丙醇溶解后为蓝色溶液,可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD 值,测定波长570nm.根据OD 值的大小计算反应体系中细胞增殖程度. 3H-TdR 掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制,这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提.一般来说,一个细胞周期可大致分为四期,即G1 期、S期、G2 期和M期.其中S期为DNA合成期,主要功能活动为DNA合成.3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（[3H-methyl]thymidine）,是DNA合成的前体.加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料.细胞合成的DNA越多,则所掺入的3H-TdR就越多,因此,检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增殖的程度.因该方法有同位素污染问题,故我们实习中仍用MTT法
细胞毒试验简介
目录 1 拼音 2 英文参考 3 操作名称 4 用品及准备 4.1 材料 4.2 试剂 5 方法及内容 6 注意事项 7 结果判读 1 拼音 xì bāo dú shì yàn 2 英文参考 cytotoxicity test 3 操作名称 细胞毒试验 4 用品及准备 4.1 材料 ①50μl加样器；②250μl加样器；③微量反应板；④倒置显微镜；⑤医用液体石蜡油；⑥尼龙纤维棉和聚乙稀塑料管(管径6mm，长160mm)。 4.2 试剂 ①抗血清。 ②兔补体，无天然细胞毒性，效价合格的混合兔血清。 ③5%伊红Y溶液。 ④12%福马林（pH7.0~7.4）。 ⑤对照组：阳性对照，用兔抗人淋巴细胞血清和抗B淋巴细胞血清；阴性对照，灭活正常人AB型混合血清。 ⑥淋巴细胞分离液（比重1.077±0.02）。 ⑦Hanks液（pH6.8~7.4）。 ⑧20%小牛血清RPM1640培养液。 ⑨淋巴细胞洗涤液和淋巴细胞保存液。 5 方法及内容 (1)向Terasaki反应板的每孔加10μl液体石蜡油。 (2)每反应板最后两孔分别加阳性和阴性对照血清，其余每孔加已知或待检血清1μl。 (3)每孔加的淋巴细胞悬液或B淋巴细胞悬液1μl，并轻轻摇动，使其与抗血清完全混匀。 (4)室温(20℃±2℃)培养30min，B细胞置于37℃温育箱1h。 (5)每孔加兔补体5μl，充分混匀，室温培养1h，B细胞2h。 (6)每孔加入5％伊红Y3μl，作用1～3min。 (7)每孔加入12％福马林8μl，室温静置1～2h或4℃冰箱过夜，置显微镜下观察结果。 6 注意事项 对淋巴细胞毒试验方法有影响的因素很多，所以一般需做多个复本。 (1)淋巴细胞：①纯度：沾染的颗粒细胞可吸收抗体，红细胞及血小板可使计数时间减慢，而引起计数误差。②浓度：细胞浓度过低，无法计数，其准确性大大下降，细胞浓度大，造成淋巴细胞集聚成团，影响结果。③pH值：中性为宜，过酸影响细胞致敏，过堿易造成假阳性。 (2)抗血清：细胞溶解和抗血清效价低也是引起计数误差的常见原因。 (3)加入补体要充足，以克服抗补体因子。 (4)染料：离心除去沉淀物与杂质。 (5)控制培养温度与时间。 7 结果判读 (1)使用倒置相差显微镜观察，计数每孔死细胞百分数。死细胞因透进了伊红Y染料色暗晦，无折光性，大而无立体感；活细胞有折光性，小而光亮。
细胞活力测定常用的简便方法？
MTT法?
又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
细胞活力测定的方法有哪些
根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50℃，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。除了干重、湿重反映细胞物质重量外，还可以通过测定细胞中蛋白质或DNA的含量反映细胞物质的量。蛋白质是细胞的主要成分，含量也比较稳定，其中氮是蛋白质的重要组成元素。从一定体积的样品中分离出细胞，洗涤后，按凯氏定氮法测出总氮量。蛋白质含氮量为16％，细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50％一80％，一般以65％为代表，有些细菌则只占13％一14％，这种变化是由菌龄和培养条件不同所产生的。因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：蛋白质总量＝含氮量×6.25核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4×`10^(-5)`NG。因此从一定体积的细菌悬液中所含的细菌中提取DNA，求得DNA含量，再计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数
