简化甲基化测序和甲基化测序的区别
什么是DNA甲基化？
简单来说，DNA甲基化就是在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5′-甲基胞嘧啶的过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育和肿瘤发生发展中起着重要作用，是目前及未来很长一段时间的研究热点之一。
DNA甲基化测序
随着高通量测序技术的发展，我们能够从全基因组水平来分析5’-甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，发现很多基因组学研究发现不了的东西，这就是 “DNA甲基化测序”！且近年来测序成本的不断下降及测序技术的迭代更新，DNA甲基化测序方法可选择性更多了。
目前表观遗传学DNA甲基化研究测序方法常见的有：全基因组重亚硫酸盐甲基化测序[WGBS]、精准DNA甲基化和羟甲基化测序[oxBS-seq]、优化版简化甲基化测序[RRBS/dRRBS/XRBS]、单/微量细胞全基因组甲基化测序[scWGBS]、扩增子（羟）甲基化测序、（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序[(h)MeDIP-seq]等6种，适用于不同DNA甲基化研究方向的解决方案。
（1）全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
常规全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
技术优势：
l 应用范围广：适用于人和大多数动植物研究（参考基因组已知）
l 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱
l 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
研究案例：
Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究
① 背景
小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。
② 方法
利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究
③ 结论
全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。
（2）精准DNA甲基化和羟甲基化测序（oxBS-seq）
DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化“金标准”的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。
技术原理：
oxBS-Seq将5hmC氧化5fC，后者可以被Bisulfite转为U，从而实现5mC的精准检测；同时，经过与常规Bisulfite结果比较可以实现对5hmC的准确检测。
技术优势：
l DNA甲基化检测全新的“金标准”
l 全基因组单碱基检测DNA羟甲基化修饰
l 多重标准验证高氧化效率和高Bisulfite转换率
l 实验偏好性低，重复性高（R2>0.98）
l 可满足多种测序应用需求：简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS），目标区域氧化甲基化测序（Target-oxBS）
研究案例：
Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution （oxBS 技术单碱基检测5mC和5hmC在鼠胚胎干细胞中的水平）
① 背景
随着5hmC在哺乳动物基因组中的发现，传统的bisulfite测序已不能精确区分5mC和5hmC的修饰差异，传统BS的测序结果中，5mC的修饰水平实际是5mC和5hmC两者信号的合集，建立一种精确区分两者的实验技术迫在眉睫。
② 方法
利用oxBS测序技术对小鼠胚胎干细胞DNA甲基化和羟甲基化进行检测和定量。
③ 结论
本研究首次建立了通过化学氧化结合重亚硫酸盐处理的实验技术。该技术首先将5hmC氧化为5fC，进而可被重亚硫酸盐转换成U，从而排除了5hmC对5mC的信号干扰，达到精确检测基因组5mC的目的。运用该技术对小鼠胚胎干细胞的研究发现，5hmC在CGI相关的转录调控区域和LINE1元件中含量较高，表明其对表观重编程可能起到重要作用。
（3）简化甲基化测序（RRBS/dRRBS/XRBS）
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。为了适应科研技术的需要，我们进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
为助力低样本量多维度分析，我们开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向测序方法：extend-ed-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。
技术优势：
l 精确度高：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率。
l 重复性好：多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%，适用于多样本间的差异分析。
l 性价比高：测序区域针对高CpG区域，数据利用率更高。
研究案例：
DNA Methyltransferase Inhibition Reverses Epigenetically Embedded Phenotypes in Lung Cancer Preferentially Affecting Polycomb Target Genes DNA甲基化的改变对癌症细胞侵袭能力的影响
① 背景
癌细胞的表型在一定程度上由表观决定，比如DNA甲基化。癌症发展后期的转移特性可能与表观遗传修饰的改变有关。
② 方法
利用RRBS技术检测具有高侵袭性的非小细胞肺癌细胞系(A549和HTB56)以及相应经过甲基化抑制剂氮杂胞苷（azacytidine）处理过的细胞系的甲基化修饰。探讨甲基化的改变对肺癌细胞系的侵袭能力的影响。
③ 结论
高侵袭性细胞系在发展过程中，DNA甲基化修饰发生了广泛的改变。同低侵袭能力的细胞系相比，RRBS检测到的CpG富集的区域中有2.5%的区域发生了差异修饰。当使用了DNA甲基化抑制剂azacytidine，伴随着这些高甲基化修饰的位点出现甲基化修饰的丢失，细胞系的侵袭能力也发生了逆转。
5-Azacytidine诱导的侵袭能力逆转
（4）单/微量细胞全基因组甲基化测序（scWGBS）
单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库测序技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了基于线性扩增和单管建库的技术，可充分降低文库偏好性，准确的完成珍贵样本的全基因组甲基化研究。
单细胞及微量珍稀样本的甲基化研究主要应用于肿瘤发生机制，癌症研究，胚胎植入前诊断，胚胎早期发育，生殖细胞重组，干细胞及细胞异质性等研究领域。应用的样本包括单细胞、微量细胞等。
技术优势：
l 超低起始量：单细胞或超低的建库DNA起始量
l 测序覆盖度高 ：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱
l 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
研究案例：
Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. 人类植入前胚胎发育的单细胞DNA甲基化组图谱
① 背景
在哺乳动物基因组上，胞嘧啶（主要是CpG二连体中的胞嘧啶）在DNA甲基化酶的催化下会发生甲基化。研究显示，DNA甲基化对多个生物学过程都至关重要，如基因表达抑制、转座子转录活性调节、X染色体的失活，以及基因组印记的维持等。此前研究显示在着床前的早期胚胎发育过程中只有大规模的DNA去甲基化。而此次研究数据显示，精子和卵细胞结合受精之后，在人类早期胚胎大规模DNA去甲基化的同时，也在大量高度特异的DNA从头加甲基化，这表明在人类早期胚胎第一轮DNA甲基化组重编程过程中，全局的DNA去甲基化‘净结果’实际上是高度有序的大规模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化两种分子过程相互拮抗产生的动态平衡的结果。
② 方法
利用单细胞DNA甲基化组高通量测序方法，首次在单细胞分辨率对人类植入前胚胎发育过程进行了更加深入的分析。
③ 结论
在这篇文章中，为了进一步在单细胞水平研究DNA甲基化重编程过程的动态特征，利用单细胞全基因组DNA甲基化组高通量测序技术，对人类植入前胚胎发育的各个关键阶段进行了单细胞、单碱基分辨率的系统研究，主要发现有：（a）首次发现了人类植入前胚胎发育过程中存在大量特异性的DNA从头加甲基。（b）首次发现从二细胞胚胎阶段开始父母本基因组上的剩余甲基化水平发生逆转，在同一个单细胞中母本基因组上的剩余甲基化水平显著高于父本基因组上的剩余甲基化水平。（c）首次发现DNA甲基化在早期胚胎卵裂过程中的不对称分配可以用来追溯同一个胚胎中每个细胞的遗传谱系。内容来源：易基因科技
甲基化测序
? ?????? WGBS全称Whole?Genome?Bisulfite?Seuqneicng： 即全基因组重亚硫酸盐测序。该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
? ?????? RRBS全称Reduced?Representation?Bisulfite?Sequencing： 即简化代表性重亚硫酸盐测序。该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理， 去除低CG含量DNA片段 ，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
? ? ? ? 相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
甲基化数据处理流程：
DNA甲基化检测方法
为什么要检测 DNA 甲基化？ 首先，我们为什么要检测 DNA 甲基化呢？检测 DNA 甲基化能回答什么问题？我们都知道，DNA 甲基化可以调控基因表达，因此检测 DNA 甲基化至少可以为解释基因表达的调控提供一些线索。其次，DNA 甲基化参与一系列重要生物学过程，包括早期胚胎发育、基因组印记、X 染色体失活、重复序列的沉默以及癌症的发生发展转移，DNA 甲基化也有助于阐明这些重要的生命过程背后隐藏的奥秘。此外，DNA 甲基化一个非常重要的应用，是可以作为肿瘤的生物标志物。DNA 甲基化如此重要，我们可能需要时刻想着它。 图 2. 人类基因组中 DNA 甲基化概况 位点特异性的 DNA 甲基化 刚才我们介绍了总体 DNA 甲基化水平的检测，但是这些方法都没有提供序列信息。如果我们需要知道位点特异性的甲基化信息，这个时候需要问第二个问题，我是只检测感兴趣的几个基因就行了，还是需要知道全基因组每一个基因的甲基化状态。如果我们只需要检测特定基因的 DNA 甲基化状态，紧接着，我们需要问第三个问题，我们只是定性地看看甲基化状态，还是定量地看甲基化的水平。 图 13. 四个问题 2.0 版本之第二、三个问题 Methylation-specific PCR，MSP 如果只是定性地看甲基化的状态，最简单快捷的是甲基化特异性的 PCR。MSP 可以快速检测 CpG 岛中任意一组 CpG 位点的 DNA 甲基化状态。 图 16. 重亚硫酸盐转化&克隆测序[7] 基于高通量测序的全基因组 DNA 甲基化检测方法 接下来，我们看一下第四个问题的另一种答案，我们用高通量测序来检测全基因组的 DNA 甲基化。之所以最后讲这个，是因为这个比较烧钱，而且后续的生物信息学分析比较复杂。 WGBS & RRBS 对于二代测序的方法，WGBS（Whole-Genome Bisulfite Sequencing）是目前的“金标准”。WGBS 想必大家都已经很熟悉了，但是考虑到 WGBS 成本较高，因此还有一种跟 WGBS 十分相似，但是只测基因组中的一部分的方法，即 RRBS（Reduced representation bisulfite sequencing）。 图 21. WGBS & RRBS 的比较[10]两者的差别在于，WGBS 通常使用超声打断整个基因组，并对整个基因组进行重亚硫酸盐处理和测序；但是 RRBS 使用 MspI 限制性内切酶。RRBS 可以检测到人类基因组中 85% 的 CpG 岛。RRBS 大约需要 100ng-1ug 的 DNA，而对于 WGBS 而言，需要 50-100ng DNA。尽管 WGBS 被誉为检测 DNA 甲基化的“金标准”，但是依然存在很多的不足。首先，重亚硫酸盐必须转化未甲基化的 DNA，否则会造成假阳性，不过目前我们可以通过加入 spike-in 作为对照来克服这个问题；还有，目前测到的 DNA 甲基化是多个细胞的平均甲基化状态，单细胞的 DNA 甲基化检测可能克服这个问题；其次，重亚硫酸盐转化，会降低基因组的复杂度，造成后续的 mapping 率不高；重亚硫酸盐转化还可能造成 DNA 断裂，这使得扩增长片段比较困难。另外，WGBS 的成本还是非常高的。 参考资料： https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIxMjA0NzU0OA==&mid=2650983484&idx=1&sn=5386066548d8e218e5087ca2ff3e8554&scene=21#wechat_redirect
如何检测 DNA 甲基化？
需要去专门的检测机构或者医院检查。DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。机制 由于Dnmtl和Dnmt3基因家族没有针对CpG二核苷酸序列的特异性，人们因此提出了DNA甲基化转移酶发现靶位点的机制。首先，甲基化转移酶并不是同等地接近所有染色体区域。具有染色体重构和DNA螺旋酶活性的蛋白质能调节哺乳动物细胞内DNA甲基化，如SNF2家族2个成员ATRX和Lsh;其次，附件因子（蛋白质、RNA等）能召集DNA甲基化转移酶到特定基因组序列或染色体结构中，如pRB蛋白等能够与Dnmtl作用，在S期晚期将它召集到高度甲基化的异染色质区。以上内容参考：百度百科-DNA甲基化
甲基化的甲基化检测方法
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。
甲基化的甲基化检测技术
曾经是2009年最值得关注的技术。遗传上除了ATGC这四种碱基，人们对第五种碱基-甲基化的胞嘧啶的兴趣也日益增加。甲基化修饰的存在对DNA转录的调控起了重要作用，异常的甲基化往往是许多疾病的起因。既然如此重要，系统绘制甲基化组的方法自然也多了起来。甲基化组（methylome）这个词还不太常见，它指的是全基因组范围内的甲基胞嘧啶。美国Salk生物研究院的Joseph Ecker及其同事刚刚通过高通量测序的方法，展现了一张人胚胎干细胞中所有甲基胞嘧啶的完整图谱。这是第一张单碱基分辨率的哺乳动物甲基化图谱，并伴随着mRNA和小RNA以及一些组蛋白修饰的比较分析。他们发现胚胎干细胞中近四分之一的甲基化是在非CG背景下，暗示胚胎干细胞采用不同的甲基化机制来影响基因调控。随着ES细胞的诱导分化，非CG甲基化消失，而在iPSC中还原。这张图谱为未来人类疾病和发育中的表观遗传学修饰研究打下了基础。美国Whitehead研究院的Meissner等也曾绘制了类似的图谱。他们利用高通量的亚硫酸氢盐测序和单分子测序，产生了覆盖大部分CpG岛的DNA甲基化图谱。他们发现，DNA甲基化模式与组蛋白甲基化模式的相关性比基因组序列更好；CpG的甲基化是动态的表观遗传标志，在细胞分化期间经历大量的改变。他们还发现，胚胎干细胞和原代细胞中与发育调控相关的“弱”CpG岛在体外增殖期间经历了异常的超甲基化，让人想起某些原发肿瘤。另外，两个独立的研究小组，分别为哈佛大学的George Church等，以及加州大学的Kun Zhang连同弗吉尼亚联邦大学的Yuan Gao等，也将传统的甲基化工具如DNA的重亚硫酸盐转化与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，定量测定人基因组中的甲基化。尽管这些甲基化图谱的绘制方法略有不同，但他们都采用了亚硫酸氢盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，并在随后的扩增步骤中转化成胸腺嘧啶。虽然很有效，但这种方法需要一些手工操作来确保完全的转化，并通过计算分析来绘制图谱。在2012年2月份，英国Oxford Nanopore Technologies的科学家提出，单分子纳米孔测序可替代这种劳动密集型的技术，测序仪能直接分辨出未修饰的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。这样，纳米孔技术就能直接读出这第五种碱基。由于纳米孔测序仅限于短的寡核苷酸，因此全基因组测序还有一段很长的路要走。此外，还有一些技术障碍需要克服，比如确保碱基以正确的次序进入纳米孔，然后从另一侧离开。不过，一旦成功，第五种碱基的直接测序将会产生重大影响。
DNA甲基化测序数据处理（二）：差异分析
衔接上一篇数据比对后的结果，使用R包DSS进行处理。 我们先来复习一下上一节课得到的数据结果： *.bismark.cov.gz 文件 这里我们使用的R包为DSS，使用 Bioconductor 进行安装。 这个包可以对甲基化数据做两件事： DSS包对差异甲基化的检测基于β负二项分布的严格沃尔德检验。 输入数据的格式如下: DML是甲基化差异位点，DMR为甲基化差异区域。 使用DSS包自带的数据进行演示 1. 载入两个包DSS和bsseq（需要该包构建obj对象） 2. 利用DMLtest函数call DML，分为一下几个步骤： 根据甲基化水平进行loci的差异分析 3. 根据dmlTest来call DML 当然，用户也可以指定差异的阈值，只有差异大于阈值的才会被call出来。 4. 根据dmlTest Call DMR 我们可以发现，smoothing前后得到的结果差异还是很大，所以针对不同的实验类型我们需要注意是否使用smoothing。 同理，也可以使用的delta参数以及调整p.threshold得到合适的结果。 5. 可视化 DSS包提供了一个不是很美观的可视化函数，用户其实可以使用coverage结果在R里面作图。 分析到此就告一段落了，随后就是自行对差异甲基化区域的注释以及可视化文献作图。 后续在处理数据的时候，发现有一个情况，多核跑DMLtest会报错，详情解决方案可见 https://github.com/haowulab/DSS/issues/13 以下为简单解决方案
甲基化反应详细资料大全
甲基化反应有机化合物分子中的 氢 被甲基(-CH3)取代的反应。 methylation 有机化合物分子中的 氢 被甲基(-CH3)取代的反应。 苯与卤甲烷在三氯化铝等催化剂作用下可发生甲基化反应生成甲苯。由于甲苯比苯更易反应，因此一般难停留在一取代阶段，往往进一步甲基化，生成多甲基苯。 醇和酚羟基中的氢可被甲基取代，生成甲基醚，用此方法可保护羟基。 最常用的甲基化试剂是碘甲烷和硫酸二甲酯。 胺与卤甲烷反应，氮上的氢被甲基取代，并且可进一步甲基化，直至彻底甲基化生成四级铵盐。
