请教ANNEXIN V-PI法检测凋亡的原理和相关试剂盒使用步骤
博凌科为生物科技-为你解答：一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依 赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。二、常见试剂盒组份 组份 Annexin V-FITC 50L 100L 250L 500L Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 25 mL2 Propidium Iodide （PI） 50L 100L 250L 500L 三、操作步骤1.悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；2.用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5105细胞；3.加入500L的Binding Buffer悬浮细胞；4.加入5L Annexin V-FITC混匀后，加入5L Propidium Iodide，混匀；5.室温、避光、反应5～15min；6.请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。A.荧光显微镜观察1.滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；2.对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；（1） 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；（2） 用PBS洗涤细胞两次；（3） 在500L 的Binding Buffer中加入2L Annexin V-FITC， 5L Propidium Iodide，混匀；（4） 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；（5） 避光、室温反应5 min。3.将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。B.流式细胞仪分析用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。四、注意事项1.Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。2.Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。3.本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1105，，不适用于检测组织样本。4.推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。5.因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。五、储存 置于40C，可保存一年
活性氧测定试剂盒测凋亡准不准
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物(O2??,H2O2, ?OH, ONOO?, ?NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。采用2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检探针。DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在时DCFH 被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质dichlorofluorescein (DCF)，其荧光在激发波长502 nm，发射波长530 nm 附近有最大波峰，强度与细胞内活性氧水平成正比。此活性氧检测系统本底低，灵敏度高，重复性好，操作简便。
如果测凋亡的话最好是用细胞凋亡检测试剂盒，购买的话可以去索莱宝。
tunel 法荧光和显色法原理的区别
TUNEL法检测细胞凋亡操作步骤
操作步骤
1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；
3.PBS漂洗2次；
4.用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min；
5.PBS漂洗2次；
6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。
8.PBS漂洗3次；
9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm）；
10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11.PBS漂洗3次；
12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min；
13.PBS漂洗3次；
14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数（200～500个细胞）并拍照。
tunel 细胞凋亡试剂盒哪家好
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒( Alexa Fluor 488)
可以用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因组DNA断裂时暴露出的3′-羟基（3′-OH）末端掺入Alexa Fluor 488-12-dUTP，从而可以用荧光显微镜或流式细胞仪检测。樊克生物 检测试剂盒
简述法医DNA技术的原理
技术原理：STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继RFLPs（限制性片段长度多态性）VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。技术背景：1、人类基因组所蕴含的约10万个基因迄今只有大约1 / 10被克隆和确定，对于复杂疾病相关的基因可能只知道一部分，按照线性思维模式去研究基因，不可能从“整体”上搞清疾病的基因机理。2、疾病相关基因是通过其相互作用参与疾病发生发展过程的，零敲碎打式研究不可能全面了解基因的网络作用。因此，应当提倡“整体式”研究模式 ——即基因组研究模式。扩展资料DNA技术其他功能：1、人类基因组计划的目的是要破译出基因密码并将其序列化制成研究蓝本，从而对诊断病症和研究治疗提供巨大帮助。基因诊断和改动技术可以使人类后代不再受遗传病的影响。2、利用基因克隆不仅可以培育出自然界不可能产生的新物种，还可制造用于人体脏器移植的器官，使人体能够抑制对异体器官的排斥，从而解决供移植的人体器官来源不足的问题。参考资料百度百科-基因鉴定技术百度百科-基因技术
法医DNA技术的原理
不管时不时法医，现有的DNA的检测技术是其基本手段，所以方法一致。
1，分子杂交技术，（包括southern杂交，northern杂交，基因芯片等）
分子杂交分析的基本原理是基于DNA探针检测变性而且固定在硝酸纤维素膜上的宿主细胞DNA。这些探针可以不依赖宿主细胞DNA来制备，例如用随机引物制备探针。探针上标记酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛标记核酸探针，操作方便、灵敏度高，已标记的探针在4℃贮存可达两年之久，方便随时应用，所以现在常采用地高辛标记核酸探针，用光标记法将光敏Dig标记到探针上，制成光敏-Dig-核酸探针，再与固定在硝酸膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交，使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合，最后可用不同的检测方式进行检测，发光检测和显色检测均可，灵敏度可达10pg以下
2，基于DNA结合蛋白的方法
Threshold? Immunoassay分析系统是基于两种DNA序列非特异性蛋白，单链DNA（ssDNA）结合蛋白（SSB）和抗ssDNA 的单抗。检测的基本过程是当生物素—DNA单链结合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的单抗与变性的宿主细胞DNA结合最终形成复合物，通过亲合素将此复合物连接到生物素—硝酸纤维素膜，在通过洗涤所有非特异性的被洗脱掉，最后放于有尿素溶液的读数仪，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 导致PH值发生变化，读数仪根据PH值的变化换算成DNA的量，从而达到检测残余DNA含量的目的。
3，PCR法，实时定量PCR法
荧光定量PCR是基于PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，产物的增加可以通过荧光信号指示，通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析。定量PCR可实时检测产物量，通过加入已知浓度的标准样品绘制标准曲线，然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度，从而达到检测残余DNA含量的目的。
请教ANNEXIN V-PI法检测凋亡的原理和相关试剂盒使用步骤
有关Annexin -PI凋亡细胞的检测使用的是BIODAI的较多，具体的步骤如下：1) 悬浮细胞：300g，4℃，离心5min，收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃，离心5min，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长(见注意事项)，以防引起假阳性。2) 用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g，4°C离心5min，收集1-5×105细胞。注意:在洗涤细胞时，尽量避免损伤细胞。3) 加入100μl 1×Binding Buffer重悬细胞。4) 加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，轻轻混匀。 5) 避光、室温反应10 min。6) 加入400μl 1 x Binding Buffer，混匀，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
细胞凋亡检测都有哪些方法？我自己做了流式，感觉做不好，想咨询下哪些公司可以做。
流式检测凋亡的方法有很多种，不同的方法适用于不同的细胞类型。目前一个很大的误区就是滥用annexin V +PI来检测各种细胞的凋亡。这个方法是为了检测悬浮细胞，比如白细胞而设计的。贴壁培养，或者直接从组织分离得到的细胞不适合用这个方法检测。因为在处理细胞的时候回造成大量的假阳性。
贴壁细胞可以采用检测caspase活性的方法来反应凋亡，而且方法很简单。目前有caspase底物结合的荧光染料。直接加到细胞培养液里面。细胞摄取后，如果处于凋亡期，细胞内的caspase-3/7激活。，降解了底物，荧光染料释放后进入细胞核，染色DNA，这个细胞在流式检测时就是阳性细胞。
这种试剂盒Invitrogen出的，有好几种颜色可选
【求助】流式细胞仪检测细胞凋亡结果该怎样分析
已经做完流式，看到结果却不知该怎样分析了。我用的是AnnexinV-FITC 凋亡试剂盒 ，AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡。请教各位，凋亡散点图中第1，2，4象限到底分别代表什么细胞？手里的资料说法都不相同。试剂盒说明书：1代表细胞收集过程中机械性损伤的细胞，2 代表继发性坏死细胞，4代表凋亡细胞。有资料说：1代表坏死细胞，2代表晚期凋亡细胞，4代表早期凋亡细胞。我就不明白了，既然是凋亡，就算是晚期，细胞膜也会破坏？还有的认为，2象限代表晚期凋亡和继发性坏死的细胞。我用的是美国Beckman-Coulter公司试剂盒，它的说明说上就是这么写的：Quadrant 3：viable cellsQuadrant 4：apoptotic cellsQuadrant 2：secondary necrotic cells这种说法在园子里还没见过。应该以说明书为准吗？我很迷茫。请您指点。
